病毒性肝炎临床诊治的基础与应用研究
作者：姚集鲁 高志良 彭晓谋 周元平 李 刚 崇雨田 邓子德 何有成 柯伟民 陆玮伦
单位：中山医科大学肝炎研究室、附属第三医院传染科； 广州， 510630
关键词：肝炎，病毒性，人；诊断；拉米夫定；治疗应用；干扰素类；治疗应用；肝炎，病毒性，人；治疗；基因疗法
中山医科大学学报990101 摘 要 病毒性肝炎是我国最重要的传染病之一，可导致严重慢性肝病，并且与肝细胞癌密切相关。近5年来，我们改进肝炎病毒核酸诊断技术，建立热变性HCV RNA直接扩增技术、RT-PCR夹心斑点杂交技术、HBV前C区点突变检测技术，以及克隆HCV、HGV基因序列。此外，对广东甲型肝炎流行病学调查与输血传播HCV、HGV及TTV人群感染的情况、慢性HBV感染者病情反复发作的因素、HCV与肝癌关系、干扰素、Lamivudine的临床治疗观察、基因治疗的应用基础研究，以及中西医结合治疗病毒性肝炎等作了一系列研究。这些技术的改进与研究成果，迅速应用到临床防治工作中，对当前病毒性肝炎诊治工作起到积极的推动作用。
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中图号 R 512.6
Basis and Applied Study of Clinical Diagnosis and
Treatment on Viral Hepatitis
Yao Jilu Gao Zhiliang Peng Xiaomao Zhou Yanping Li Gang
Chong Yutian Deng Zhide He Youcheng Ke Weiming Lu Weilun
(Hepatitis Institute, Depatment of Infectious Diseases, The Third Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou, 510630)
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Abstract Viral hepatitis is one of the most important infectious diseases in China. It is the most common cause of chronic hepatitis and is closely related to hepatocellular carcinoma. In the past 5 years, we have improved the molecular biology techniques for the diagnosis of this group of diseases, including the establishment of direct-amplified heat-denatured detection of HCV RNA, detection of pre-core region mutant of HBV with RT-PCR, dot hybridization and the sequence cloning of HCV and HGV. A series of epidemiologic studies including the investigation of epidemiology of HAV in Guangdong, as well as risk factors study on transmission of HCV, HGV and acute exacerbation in chronic hepatitis B patients was carried out. Preliminary basic study on gene therapy and a series of studies on combination of Chinese traditional medicine with western medicine are also in progress. All these achievements have been rapidly applied to clinical practice and played important roles in the advance of diagnosis and treatment in viral hepatitis.
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Subject headings hepatitis, viral/diagnosis; lamivudine/therapeutic use; interferons/therapeutic use; hepatitis,viral/therapy; gene therapy
目前我国病毒性肝炎感染情况仍然很严重。甲型肝炎总流行率为80.9%，乙型肝炎表面抗原携带率为9.75%估计实际人数超过1.2亿，乙型肝炎病毒(HBV)感染总流行率为57.63%。丙型肝炎标化流行率为3.2%，戊型肝炎为17.2%。目前又发现一些新的肝炎病毒，如庚型肝炎病毒(HGV)、TT病毒(TTV)等。感染肝炎病毒后所致慢性肝炎、肝硬化及肝细胞癌是造成众多病人病情不愈、加重及死亡的主要原因。因而，病毒性肝炎的防治研究成为我国疾病控制的重大问题。本室过去5年来，在不断追踪国内外最新研究技术与方法的基础上，创建敏感的诊断技术，积极开展抗病毒治疗，免疫病理研究等，对病毒性肝炎有关的临床热点问题进行了一系列研究观察，现分述如下。
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1 诊断技术
1.1 改进分子检测技术
1.1.1 热变性HCV RNA模板直接扩增法技术 彻底提纯样本或充分除去样本中的抑制因子是巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HCV RNA成功的关键。同时，在处理过程中，如何抑制RNase活性和避免污染也是至关重要的。我科采用直接裂解制备样本进行PCR扩增，加ρ=0.5%硫基乙醇进行热裂解来制备样本，先用300 mg/L的蛋白酶K于55 ℃将血浆消化30 min再进行热变性，离心后，取上清液进行RT-PCR扩增[1～3]。
本方法与目前常用的酸胍酚一步法比较，其敏感性与特异性一样，检出率相符，本法检测仅需4 h，而酸胍酚法约需36 h，明显缩短了时间。该法操作简便，不易出现污染，由于操作简化，有利推广。
1.1.2 RT-PCR夹心斑点杂交技术 建立相应的重组体。载体选用P t 7 t 3，将质粒pUN中的HCV 5′端非编码区300 bp的cDNA片段亚克隆到选用载体中。经转化、增殖，M13K07超感染，可从培养上清中制备纯化重组的单链DNA，作为一级探针(不标记)。因避免了双链探针的自身复杂性问题，这种单链DNA探针杂交效率要高很多。
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标记通用二级核酸探针。Pt 7 t 3空载体经转化、增殖后，按需要量制血双链DNA，线性化后按随机引物法标记Dig，即为二级标记探针。这种探针灵敏度高，操作简便，无放射性污染，-20 ℃可有效保存1年以上。
RT-PCR夹心斑点杂交法放大检测血清标本中HCV RNA，先用RT-PCR对待检标本进行单轮扩增，产物经99 ℃ 15 min，冰浴骤冷，点样于硝酸纤维素膜(NCM)，烘膜固定后即可用夹心斑点杂交法放大鉴定。由于充分利用了单链一级探针杂交的高效性和通用二级探针的信号高倍放大作用，省去了第2轮PCR扩增，减少多次PCR操作及高扩增造成的假阳性率偏高问题，降低实验费用，探针杂交结果也比电泳后观察条带更肯定、更特异[4～7]。
1.1.3 改变引物3′端检测HBV前C区点突变 乙型肝炎病毒感染后可发生变异。变异后逃避免疫攻击，引起病毒复制持续，造成病情迁延不愈。我们采用引物3′限定扩增的方法研究HBV前C区点突变，发现HBV这种变异在慢性肝炎中可达70.1%，肝硬化中70.6%，肝细胞癌7.5%，较急性肝炎25.0%及HBV携带者19.2%明显高(P<0.01)[8，9]。
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1.1.4 肝脏纤维化指标检测 肝炎病毒感染所致肝纤维化是慢性肝炎、肝硬化发生、发展的重要因素。开展对一系列肝纤维化指标的检测如：血清透明质酸酶、前胶原等，有利于判断慢性肝病的发展，为抗纤维化治疗提供疗效考核的指标。在10余种肝纤维化血清指标中，我们观察结果表明，以透明质酸酶(HA)的临床意义较大。对164例病毒性肝炎患者测定HA，发现血清HA水平随肝纤维化发展而升高，在肝硬化组最高。结合其病理结果分析，HA与肝内炎症、坏死及纤维化程度呈正相关[10，11]。
1.2 分子克隆与测序工作
1.2.1 HCV 首先对HCV广东株5′NCR， E1，E2/NS1区进行分子克隆和序列测定，经同源性比较，证实为1b基因型；在国内首次报道采用酶切法以E1，E2/NS1区作为分型区段；在国内率先报道肝细胞癌中HCV的序列，并与非肝癌的慢性丙型肝炎HCV序列比较，发现同源性；对HCV包膜蛋白进行体外融合表达，对HCV特异性受体的研究中可能有重要作用；HCV 5′NCR cDNA进行体外转录，体外合成HCV RNA，作为逆转录和PCR的阳性对照模板，对消除PCR过程中的假阳性有重要作用[12～15]。
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1.2.2 HGV 首先报道HGV广东株的分子克隆和序列测定，对多个不同株(包括云南、广东、香港)的5′NCR进行同源性分析。对华南地区1991份不同人群的血清标本进行HGV流行病学调查，发现接受骨髓移植、血液透析、静脉吸毒者、乙型、丙型、非甲～戊型肝炎病人及肝细胞癌患者是HGV的高感染人群；不同HGV株存在一定的地区性差异，同一地区不同人群的HGV株变异不明显；感染HGV后短时期内(3个月)无变异；序列中存在高度保守区及较大变异区[16～18]。
2 流行病学
2.1 广州地区正常人群甲型肝炎血清流行病学调查
继80年代初期之后，我科再次在90年代初期在较大样本的人群中，用ELISA法检测了1 014名正常人不同年龄组血清抗HAV-IgG的水平，1～10岁组的抗体阳性率仅为30%左右，11岁后的抗体阳性率随年龄增长而上升(>50%)，21～30岁组达到高峰(77.2%)。各年龄组的抗体滴度亦有较大的差异[19]。随后通过粤港两地的调查比较表明，广州的抗HAV阳性年龄分布曲线与香港70年代的情况相似。
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2.2 输血与丙型肝炎关系的前瞻性研究
我们采用前瞻性研究方法，对52例输血前无丙型肝炎病毒(HCV)感染的受血者及30例无输血的对照组随访检测ALT、抗-HCV、HCV RNA等项目并进行临床观察。结果显示：①52例受血中有9例符合输血后丙型肝炎的诊断，发生率为17.3%，对照组30例无1例感染HCV，两组比较有统计学差异(P<0.05)，且趋势检验χ2=16.67，P<0.05；②9例输血后丙型肝炎患者中的8例经1年随访，均转为慢性丙型肝炎；③导致9例输血后丙型肝炎的献血员血清标本(共45份)，经第2代ELISA方法(1995年)复检抗-HCV，仅有1份为抗-HCV可疑阳性，余44份阴性；而采用逆转录PCR(RT-PCR)法检测上述标本的HCV RNA，则有12份HCV RNA阳性，33份阴性。结论：在90年代初、中期用于筛选献血员的方法(第2代ELISA法检测抗-HCV)尚不够灵敏，不足以筛去有可能导致HCV传播的供血，也可能与部分HCV感染者，缺乏或呈低效价的抗-HCV，但其HCV RNA阳性，仍然具有传染性，导致当时输血传播丙型肝炎相当常见，而且输血量越多，感染HCV的机会越大，丙型肝炎慢性化率高。因此避免不必要的输血以预防输血后丙型肝炎的发生仍然是应强调的原则[20～23]。
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2.3 HGV感染调查
HGV是近年来新发现的全球分布的一种可能与肝炎有关的病毒。我们在广东地区开展了一系列的临床血清流行病学研究，探讨其发病情况，致病性等。对351例住院肝炎病人检测发现，32例(9.11%)HGV RNA阳性，34例(9.68%)抗 HGV阳性。HGV多数重叠其它肝炎病毒感染，重叠感染率7.8%(39/497)，有输血史的病人HGV RNA阳性率(16.0%)高于无输血史的患者(6.4%)(P<0.01)。在84例静脉毒瘾者中15例检出HGV RNA，阳性率17.9%，且HGV RNA阳性病例中11例合并丙型肝炎病毒感染。反映HGV主要经输血途径传播。在部分没有甲～戊型肝炎证据的病人中的HGV感染，表现了肝功能异常，极个别有重症肝炎表现，是否HGV单独致病有待进一步研究[24～29]。
2.4 TT病毒感染调查
我们对340名ALT正常和19名ALT异常健康体检者的血清，90份献血员，60例血透患者和156例肝病患者的血标本，采用PCR检测TTV DNA，其检出率分别为1.8%、10.5%、2.2%、8.3%和4.5%，其中ALT升高体检人群和血透患者的TTV DNA检出率显著高于ALT正常健康体检人群，P值分别为<0.05和<0.01。
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由广东分离的TTV病毒，经PCR产物测序，其同源性与Takahashi等分离株和Okamoto等分离株相比分别为98.2%和89.2%。在肝炎病人中TTV病毒与其它肝炎病毒重叠感染，无法确定其单独致病性。
3 发病机理
3.1 慢性乙型肝炎急性发作与血清HBV DNA含量关系
采用荧光标记(amplisensor)定量方法测定11例患者中有9例(82%)血清HBV DNA含量的高峰值是在最大肝损害之前出现，或与谷丙转氨酶(ALT)同时达到高峰。另2例的高峰值则出现在恢复期。测定2例数次发作的慢性乙型肝炎患者的系列血清中HBV DNA，也显示了上述特点。另1例肝炎肝硬化多次急性发作中，显示持续高水平的病毒血症。对44例自发性发作的慢性乙型肝炎患者进行肝组织活检，比较其血清中HBV DNA含量，结果显示血清HBV DNA含量与肝脏炎症程度(G1～G4)及纤维化程度(S1～S4)之间无明显相关性(P<0.05)，与血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及总胆红素(T-Bili)之间也无相关性。这种情况可能是HBV的复制活跃先于肝损害加重，并可能是启动机体免疫应答的因素，但HBV DNA绝对值与肝细胞损伤的程度没有关系[30]。
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3.2 HBV感染者重叠HEV感染致病情明显加重
乙型肝炎病毒感染在人群中感染率高，重叠其它肝炎病毒感染可导致病情明显加重，尤以HEV明显。对384例慢性乙型肝炎感染检查重叠感染情况，其中16.6%重叠HEV感染，重症肝炎中更为明显(22.73%)[31～33]。
3.3 重症肝病患者体内TNF-α和IL-6水平的研究
为进一步探讨某些细胞因子在重症肝炎发病机理中的作用及其意义，我们用双抗体夹心ELISA法测定了30例重症肝炎患者血清肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)水平的变化。研究结果提示血清TNF-α和IL-6水平与肝细胞坏死程度密切相关。重肝患者血清TNF-α和IL-6的显著升高亦与肝炎病毒的重叠感染和内毒素血症有密切关系。
为了在细胞因子水平上阐明严重感染与慢性肝病重症化之间的关系，探讨肝炎肝硬化失代偿期患者体内TNF-α和IL-6水平与感染的关系及其对诊断和预后的判断价值，我们检测了肝炎肝硬化患者血清和腹水TNF-α和IL-6水平。我们的研究结果表明， 肝硬化患者血清和腹水TNF-α和IL-6的检测对判断感染的存在和预后有一定的临床实用价值。 提出在腹水培养阴性的情况下， 腹水IL-6≥1 200 ng/L可作为诊断原发性细菌性腹膜炎(SBP)的一项指标，具有灵敏性较高，特异性较强，快速简便的优点[34，35]。
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3.4 HCV与HCC关系的研究
针对我国肝癌高发及丙型肝炎流行的状况，对丙型肝炎病毒(HCV)在肝癌发生中的病因作用及与其它因素的协同作用，从人群、细胞和分子等宏观到微观不同水平上率先进行了系列研究与报道。
3.4.1 在人群水平上 通过病例对照研究Logistic回归分析(3个样本，抽样于华南地区、广州市和顺德)，在我国HBV高流行背景下，发现HCV仍为独立的致肝癌因素(OR=8.0-15.8)；与HBV有协同致肝癌作用；不同肝病组的病毒血清学、临床和病理比较分析均揭示HCV、HBV重叠感染是我国肝癌的突出现象。临床上随访66例重叠感染病例，41个月后发现肝硬化发生率(32.25%)显著高于单独HBV或HCV组，并在重叠感染组中出现2例原发性肝癌提示肝硬化是重要的中间环节。
3.4.2 在组织细胞水平上 采用地高辛标记逆转录原位PCR技术，分析HCV RNA在肝癌组织中的定位和分布，发现肝癌和癌周肝组织中HCV RNA主要呈胞浆型分布，在癌细胞中核型、核膜型分布明显增高，免疫组化分析也证实肝癌组织中HCV抗原的存在和分布特点，表明HCV基因组与宿主基因组可能存在相互作用，并与HCV的致癌机理有关；采用高效液相色谱定量检测肝癌组织中的黄曲霉毒素，同时用改进的巢式PCR技术检测肝癌组织中的HCV RNA和HBV DNA，这3种因子的检出率分别为69.2%、12.7%和90.5%。发现HCV与HBV或者黄曲霉毒素双阳性或三阳性时存在着明显的协同致癌作用。协同致癌作用的理论观点可较合理地解释我国东南沿海肝癌高发的现象。由于我国HBV感染基数高，黄曲霉毒素污染实际存在而易忽视，协同致癌作用的观点为采取综合措施降低华南特别是广东省肝癌高发提供了重要理论依据。
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3.4.3 在分子水平上 利用特异性引物的限制作用，在国内首次在肝癌组织中鉴定并报道(1993年上海国际肝病会议)存在HCV复制中间体，提供了HCV与肝癌相关的深入证据；用克隆测序的方法从肝癌患者血清中获得780 bp的HCV cDNA片段，序列分析表明，与我国HCC相关的HCV为Ⅱ型病毒，并在特殊氨基酸位置存在较大变异，这在国内亦为首次报道；采用PCR/SSCP、PCR/RFLP技术结合DNA序列分析，首先报道了广东地区肝细胞癌患者中宿主基因— p53基因的突变情况，突变率为36%，突变部位95.8%在密码子249，突变方式为第3个碱基的G→T转换。采用新方法直接观察到p53基因的杂合性丢失情况，杂合性丢失率为68.4%。进一步分析发现，HBV、HCV感染与p53基因改变密切相关，揭示HBV DNA的存在，以及HBV、HCV感染引起的肝硬化过程是HBV、HCV感染与p53基因改变的重要因素。黄曲霉素摄入和HBV、HCV感染是p53基因密码子249突变的主要原因，其中，HBV、HCV感染的意义相对重要，因为，病毒感染不仅能引起突变还可引起基因发生杂合性丢失[36～52]。
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以上系列研究的结果和发现，为我国特别是华南地区肝癌的一级预防和二级预防提供了重要实验和理论依据，提出切实地采取综合处理措施，阻断协同致肝癌作用，对降低肝癌率的发病具有重要意义。
3.5 病毒性肝炎与脂肪肝的发生
在69例非酒精性脂肪肝患者中分别检出HBs-Ag阳性25例(36.23%)、抗HCV阳性8例(11.59%)，合计HBV与HCV现症感染率为47.82%；对照组138名健康体检者中HBsAg阳性17例(12.32%)，抗HCV阳性2例(1.45%)，合计HBV与HCV现症感染率为13.77%(两组比较P值分别<0.01、0.01和0.001)。调查显示在非酒精性脂肪肝患者中普遍存在慢性HBV、HCV感染。结果提示持续存在慢性HBV、HCV现症感染与脂肪肝有密切关系，可能是非酒精性脂肪肝的重要原因之一[53～55]。
4 治 疗
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4.1 抗病毒治疗
4.1.1 α-干扰素治疗乙型与丙型肝炎的临床疗效近5年时间，我们使用各种干扰素(INF)治疗乙型与丙型肝炎近500余例，获得了丰富的临床经验。我们应用α-干扰素(INF-α)治疗急、慢性丙型肝炎患者，以同期收治而未用INF-α治疗的病例作随机对照，观察INF-α治疗丙型肝炎的临床疗效和远期疗效(停药后随访6～12个月)。结果表明，急性丙型肝炎患者应用INF-α治疗3～6个月后，ALT复常率为80%，对照组为20%，停药后半年内复发率为37.5%，疗效显著优于对照组。慢性丙型肝炎患者应用INF-α治疗6个月后，ALT复常率为40%，停药后复发率高。INF-α治疗组血清HCV RNA的阴转与ALT的复常有密切相关，而大多数患者治疗前后血清抗-HCV的效价无显著差异(P>0.05)，故不认为血清抗-HCV是临床上考核IFN抗病毒疗效的灵敏指标。INF治疗乙型肝炎可使部分(25%～40%)HBeAg转阴，虽然INF治疗乙型肝炎的疗效不尽人意，但国际上依然将其作为乙型肝炎抗病毒治疗的首选药物。经过大量临床观察，我们应用INF治疗丙型肝炎用隔天3MU，12个月疗程，治疗乙型肝炎用隔天5MU，不少于6个月的疗程[56～58]。
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我们比较了4种常用的干扰素制剂，在98例病毒性肝炎病人，治疗前后，治疗期间干扰素抗体的产生情况，结果显示：总的阳性率为34.7%；该抗体的产生与病人的性别、年龄、治疗前ALT水平、肝炎病毒感染类型、以及肝炎的临床类型均无显著相关。低剂量干扰素较易产生中和抗体。使用不同干扰素制剂产生中和抗体有差异，其中以r-INF-α 2 α最高，INF-α N1最低。但抗体的出现对干扰素的疗效影响不大[59]。
4.1.2 拉米夫定治疗慢性乙型肝炎病毒感染 HBV不断复制，病毒不能清除是造成慢性乙型肝炎反复发作，迁延不愈的主要原因，近10多年来慢性乙型肝炎的抗病毒治疗一直是国内外临床研究的热点，虽然α-干扰素及一些免疫调节剂对抑制HBV的复制有一定的效果，但疗效远不尽人意。
拉米夫定(2，-3-双脱氧核苷3-硫胞嘧啶)是一种毒性低、在人体内吸收快、生物利用度大的新的胞嘧啶核苷类似物。我科被卫生部指定为该药在全国多中心进行临床试验单位之一。从1996年12月开始对88例慢性HBV感染者进行了严格按照美国FDA要求和中国卫生部新药临床研究指导原则的临床试验：88例随机分入拉米夫定治疗组(66例)和安慰剂对照组(22例)，在头12周，按双盲法每人每天口服拉米夫定100 mg(1片)，或安慰剂1片，第13周起所有病人均继续服拉米夫定100mg.d-1，至52周末结束。结果在头12周结束时，HBV DNA阴转率拉米夫定组为92%，安慰剂组均仅为9%，两组比较P<0.001。在52周治疗结束时，拉米夫定组及安慰剂组的最终HBV DNA阴转率分别为69%与77%，但若扣除中途脱落者，两组的HBV DNA阴转率实际分别为87.5%(42/48)与85%(17/20)，两组的ALT复常率亦相似(65%对70%)，统计学均无显著差异(P>0.05)，血清HBeAg阴转，抗-HBe阳转率治疗前后无明显差异。
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两组病人在治疗1年中，对拉米夫定的耐受性均良好，两组不良反应发生频率均相似，并无严重不良反应或肝、肾功能损害、骨髓抑制等发生。结论认为拉米夫定能迅速有效抑制HBV的复制，并可改善肝功能，口服100 mg.d-1,1年的治疗安全、有效。
4.2 基因治疗的应用基础研究
4.2.1 硫代修饰三螺旋形成寡脱氧核苷酸及反义寡脱氧核苷酸抗HBV作用研究 ①以HBV核心启动子1 734～1 754 nt(含SP1位点)、前C RNA、前基因组RNA5′端帽区及翻译起始区为靶点，设计、合成了21 mer硫代修饰三螺旋形成寡脱氧核苷酸(TF 021)、反义寡脱氧核苷酸(ODNas 21)及无关序列对照寡脱氧核苷酸(ODNcon)。②在HBV模型细胞— HepG 2 22.1.5细胞研究了TF 021、ODNas 21对HBV复制及抗原合成的抑制作用。③研究了TF 021、ODNas 21对HepG 2 22.1.5细胞的毒性作用。结果：①TF 021，ODNas 21能有效抑制HBV复制及HBsAg，HBeAg合成。②该抑制与作用时间有关，并呈剂量依赖性。③TF 021与ODNas 21 联合给药抑制作用增强。④硫代寡核苷酸对22.1.5细胞无毒性作用[60]。
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4.2.2 逆转录病毒介导反义HBV前C/C基因转移的抗HBV作用研究 ①用BamHⅠ酶切HBV(ayw)质粒pHBV获得了1 504 bp的HBV前C/C基因片段，将其正、反向插入逆转录病毒载体pDOR，构建了正、反义前C/C重组体。②将重组体转染逆转录病毒包装细胞PA317，用G 418筛选获得了抗性细胞及正、反义重组逆转录病毒。③采用PCR及RT-PCR检测了逆转录病毒载体介导反义前C/C基因转移及产生HBV反义RNA的水平。④在22.1.5细胞研究了逆转录病毒介导的反义HBV前C/C基因转移的抗HBV作用及对22.1.5细胞的毒性作用。结果：①逆转录病毒载体能有效转移反义前C/C基因并能转录、产生HBV反义RNA。②在22.1.5细胞，逆转录病毒介导的反义HBV前C/C基因转移、表达能有效抑制HBV复制及HBsAg、HBeAg合成，该抑制具有特异性。③增加重组逆转录病毒感染次数能在一定程度提高抗HBV作用。④重组逆转录病毒感染对22.1.5细胞无明显毒性作用[61]。
4.3 慢性肝炎肝硬化的中西医结合治疗
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于1986年开始从事这方面的研究。自此以后10年来，本科先后开发肝酶灵注射液、和肝胶囊、宁肝丹胶囊、复肝酶胶囊、强肝胶囊等多种制剂，在本科肝病患者中应用，并逐渐形成医疗特色，创造了良好而稳定的社会与经济效益。
4.3.1 肝酶灵注射液对慢性病毒性肝炎尤其是乙型肝炎进行了较大规模和较长时间的临床应用 通过66例慢性乙型肝炎患者的对照观察表明，经过疗程为3个月的肝酶灵肌肉注射治疗，原先ALT呈2倍以上升高的患者获得77.27%的复常率，并且53.03%的患者出现HBeAg阴转，两项指标均明显优于对照组。结果表明肝酶灵注射液对慢性乙型肝炎不但具有保护肝细胞作用，同时还观察到一定的抑制HBV复制的作用。肝酶灵注射液价格较为低廉，是一种适合我国国情的制剂[62，63]。
4.3.2 改良小柴胡汤制剂——和肝胶囊 我们曾应用和肝胶囊对81例肝病患者进行治疗，观察其对血清肝纤维化标志物的影响。结果显示和肝胶囊治疗可使血清透明质酸(HA)和Ⅲ型前胶原肽(PHIP)由治疗前的(245.89±148.49) μg/L和(261.89±134.42) μg/L分别降至(125.43±85.46) μg/L和(144.04±83.99) μg/L(P=0.000)，下降幅度分别为(120.45±89.71) μg/L和(117.85±73.64) μg/L，均优于对照组；治疗组的HA和PIIIP复常率分别为34.38%(22/64)和50.68%(37/73)。提示改良小柴胡汤制剂对肝纤维化过程具有一定的抑制作用[64]。
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4.4 抗肝炎药物的临床验证
近年来，作为卫生部抗肝炎与寄生虫药物临床试验基地以及广东省新药(抗感染)临床试验研究中心，我们接受国内外数10种与治疗肝炎有关的药物如：α-胸腺素(日达仙)、前列腺素、肝细胞生长因子等进行临床验证。为肝炎的上市治疗药物进行评估，从而为临床正确使用提供了依据。
在病毒性肝炎诊治方面，我们做了大量的工作，取得了较大的成绩，为广东省病毒性肝炎防治作出了积极的贡献。由于病毒性肝炎防治工作难度大，仍然有许多问题尚未解决。因而，将在我们已有的研究工作基础上，对一些病毒性肝炎热点与焦点问题，特别是发病机理、定量检测、新的治疗方法的研究与应用等方面进一步深入研究。
卫生部部属校重点项目、卫生部优秀人才等基金资助课题；获国家教委科委进步二等奖
参考文献
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(1998 - 11 - 25收稿 1998 - 12 - 05修回), 百拇医药
单位：中山医科大学肝炎研究室、附属第三医院传染科； 广州， 510630
关键词：肝炎，病毒性，人；诊断；拉米夫定；治疗应用；干扰素类；治疗应用；肝炎，病毒性，人；治疗；基因疗法
中山医科大学学报990101 摘 要 病毒性肝炎是我国最重要的传染病之一，可导致严重慢性肝病，并且与肝细胞癌密切相关。近5年来，我们改进肝炎病毒核酸诊断技术，建立热变性HCV RNA直接扩增技术、RT-PCR夹心斑点杂交技术、HBV前C区点突变检测技术，以及克隆HCV、HGV基因序列。此外，对广东甲型肝炎流行病学调查与输血传播HCV、HGV及TTV人群感染的情况、慢性HBV感染者病情反复发作的因素、HCV与肝癌关系、干扰素、Lamivudine的临床治疗观察、基因治疗的应用基础研究，以及中西医结合治疗病毒性肝炎等作了一系列研究。这些技术的改进与研究成果，迅速应用到临床防治工作中，对当前病毒性肝炎诊治工作起到积极的推动作用。
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中图号 R 512.6
Basis and Applied Study of Clinical Diagnosis and
Treatment on Viral Hepatitis
Yao Jilu Gao Zhiliang Peng Xiaomao Zhou Yanping Li Gang
Chong Yutian Deng Zhide He Youcheng Ke Weiming Lu Weilun
(Hepatitis Institute, Depatment of Infectious Diseases, The Third Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou, 510630)
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Abstract Viral hepatitis is one of the most important infectious diseases in China. It is the most common cause of chronic hepatitis and is closely related to hepatocellular carcinoma. In the past 5 years, we have improved the molecular biology techniques for the diagnosis of this group of diseases, including the establishment of direct-amplified heat-denatured detection of HCV RNA, detection of pre-core region mutant of HBV with RT-PCR, dot hybridization and the sequence cloning of HCV and HGV. A series of epidemiologic studies including the investigation of epidemiology of HAV in Guangdong, as well as risk factors study on transmission of HCV, HGV and acute exacerbation in chronic hepatitis B patients was carried out. Preliminary basic study on gene therapy and a series of studies on combination of Chinese traditional medicine with western medicine are also in progress. All these achievements have been rapidly applied to clinical practice and played important roles in the advance of diagnosis and treatment in viral hepatitis.
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Subject headings hepatitis, viral/diagnosis; lamivudine/therapeutic use; interferons/therapeutic use; hepatitis,viral/therapy; gene therapy
目前我国病毒性肝炎感染情况仍然很严重。甲型肝炎总流行率为80.9%，乙型肝炎表面抗原携带率为9.75%估计实际人数超过1.2亿，乙型肝炎病毒(HBV)感染总流行率为57.63%。丙型肝炎标化流行率为3.2%，戊型肝炎为17.2%。目前又发现一些新的肝炎病毒，如庚型肝炎病毒(HGV)、TT病毒(TTV)等。感染肝炎病毒后所致慢性肝炎、肝硬化及肝细胞癌是造成众多病人病情不愈、加重及死亡的主要原因。因而，病毒性肝炎的防治研究成为我国疾病控制的重大问题。本室过去5年来，在不断追踪国内外最新研究技术与方法的基础上，创建敏感的诊断技术，积极开展抗病毒治疗，免疫病理研究等，对病毒性肝炎有关的临床热点问题进行了一系列研究观察，现分述如下。
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1 诊断技术
1.1 改进分子检测技术
1.1.1 热变性HCV RNA模板直接扩增法技术 彻底提纯样本或充分除去样本中的抑制因子是巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HCV RNA成功的关键。同时，在处理过程中，如何抑制RNase活性和避免污染也是至关重要的。我科采用直接裂解制备样本进行PCR扩增，加ρ=0.5%硫基乙醇进行热裂解来制备样本，先用300 mg/L的蛋白酶K于55 ℃将血浆消化30 min再进行热变性，离心后，取上清液进行RT-PCR扩增[1～3]。
本方法与目前常用的酸胍酚一步法比较，其敏感性与特异性一样，检出率相符，本法检测仅需4 h，而酸胍酚法约需36 h，明显缩短了时间。该法操作简便，不易出现污染，由于操作简化，有利推广。
1.1.2 RT-PCR夹心斑点杂交技术 建立相应的重组体。载体选用P t 7 t 3，将质粒pUN中的HCV 5′端非编码区300 bp的cDNA片段亚克隆到选用载体中。经转化、增殖，M13K07超感染，可从培养上清中制备纯化重组的单链DNA，作为一级探针(不标记)。因避免了双链探针的自身复杂性问题，这种单链DNA探针杂交效率要高很多。
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标记通用二级核酸探针。Pt 7 t 3空载体经转化、增殖后，按需要量制血双链DNA，线性化后按随机引物法标记Dig，即为二级标记探针。这种探针灵敏度高，操作简便，无放射性污染，-20 ℃可有效保存1年以上。
RT-PCR夹心斑点杂交法放大检测血清标本中HCV RNA，先用RT-PCR对待检标本进行单轮扩增，产物经99 ℃ 15 min，冰浴骤冷，点样于硝酸纤维素膜(NCM)，烘膜固定后即可用夹心斑点杂交法放大鉴定。由于充分利用了单链一级探针杂交的高效性和通用二级探针的信号高倍放大作用，省去了第2轮PCR扩增，减少多次PCR操作及高扩增造成的假阳性率偏高问题，降低实验费用，探针杂交结果也比电泳后观察条带更肯定、更特异[4～7]。
1.1.3 改变引物3′端检测HBV前C区点突变 乙型肝炎病毒感染后可发生变异。变异后逃避免疫攻击，引起病毒复制持续，造成病情迁延不愈。我们采用引物3′限定扩增的方法研究HBV前C区点突变，发现HBV这种变异在慢性肝炎中可达70.1%，肝硬化中70.6%，肝细胞癌7.5%，较急性肝炎25.0%及HBV携带者19.2%明显高(P<0.01)[8，9]。
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1.1.4 肝脏纤维化指标检测 肝炎病毒感染所致肝纤维化是慢性肝炎、肝硬化发生、发展的重要因素。开展对一系列肝纤维化指标的检测如：血清透明质酸酶、前胶原等，有利于判断慢性肝病的发展，为抗纤维化治疗提供疗效考核的指标。在10余种肝纤维化血清指标中，我们观察结果表明，以透明质酸酶(HA)的临床意义较大。对164例病毒性肝炎患者测定HA，发现血清HA水平随肝纤维化发展而升高，在肝硬化组最高。结合其病理结果分析，HA与肝内炎症、坏死及纤维化程度呈正相关[10，11]。
1.2 分子克隆与测序工作
1.2.1 HCV 首先对HCV广东株5′NCR， E1，E2/NS1区进行分子克隆和序列测定，经同源性比较，证实为1b基因型；在国内首次报道采用酶切法以E1，E2/NS1区作为分型区段；在国内率先报道肝细胞癌中HCV的序列，并与非肝癌的慢性丙型肝炎HCV序列比较，发现同源性；对HCV包膜蛋白进行体外融合表达，对HCV特异性受体的研究中可能有重要作用；HCV 5′NCR cDNA进行体外转录，体外合成HCV RNA，作为逆转录和PCR的阳性对照模板，对消除PCR过程中的假阳性有重要作用[12～15]。
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1.2.2 HGV 首先报道HGV广东株的分子克隆和序列测定，对多个不同株(包括云南、广东、香港)的5′NCR进行同源性分析。对华南地区1991份不同人群的血清标本进行HGV流行病学调查，发现接受骨髓移植、血液透析、静脉吸毒者、乙型、丙型、非甲～戊型肝炎病人及肝细胞癌患者是HGV的高感染人群；不同HGV株存在一定的地区性差异，同一地区不同人群的HGV株变异不明显；感染HGV后短时期内(3个月)无变异；序列中存在高度保守区及较大变异区[16～18]。
2 流行病学
2.1 广州地区正常人群甲型肝炎血清流行病学调查
继80年代初期之后，我科再次在90年代初期在较大样本的人群中，用ELISA法检测了1 014名正常人不同年龄组血清抗HAV-IgG的水平，1～10岁组的抗体阳性率仅为30%左右，11岁后的抗体阳性率随年龄增长而上升(>50%)，21～30岁组达到高峰(77.2%)。各年龄组的抗体滴度亦有较大的差异[19]。随后通过粤港两地的调查比较表明，广州的抗HAV阳性年龄分布曲线与香港70年代的情况相似。
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2.2 输血与丙型肝炎关系的前瞻性研究
我们采用前瞻性研究方法，对52例输血前无丙型肝炎病毒(HCV)感染的受血者及30例无输血的对照组随访检测ALT、抗-HCV、HCV RNA等项目并进行临床观察。结果显示：①52例受血中有9例符合输血后丙型肝炎的诊断，发生率为17.3%，对照组30例无1例感染HCV，两组比较有统计学差异(P<0.05)，且趋势检验χ2=16.67，P<0.05；②9例输血后丙型肝炎患者中的8例经1年随访，均转为慢性丙型肝炎；③导致9例输血后丙型肝炎的献血员血清标本(共45份)，经第2代ELISA方法(1995年)复检抗-HCV，仅有1份为抗-HCV可疑阳性，余44份阴性；而采用逆转录PCR(RT-PCR)法检测上述标本的HCV RNA，则有12份HCV RNA阳性，33份阴性。结论：在90年代初、中期用于筛选献血员的方法(第2代ELISA法检测抗-HCV)尚不够灵敏，不足以筛去有可能导致HCV传播的供血，也可能与部分HCV感染者，缺乏或呈低效价的抗-HCV，但其HCV RNA阳性，仍然具有传染性，导致当时输血传播丙型肝炎相当常见，而且输血量越多，感染HCV的机会越大，丙型肝炎慢性化率高。因此避免不必要的输血以预防输血后丙型肝炎的发生仍然是应强调的原则[20～23]。
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2.3 HGV感染调查
HGV是近年来新发现的全球分布的一种可能与肝炎有关的病毒。我们在广东地区开展了一系列的临床血清流行病学研究，探讨其发病情况，致病性等。对351例住院肝炎病人检测发现，32例(9.11%)HGV RNA阳性，34例(9.68%)抗 HGV阳性。HGV多数重叠其它肝炎病毒感染，重叠感染率7.8%(39/497)，有输血史的病人HGV RNA阳性率(16.0%)高于无输血史的患者(6.4%)(P<0.01)。在84例静脉毒瘾者中15例检出HGV RNA，阳性率17.9%，且HGV RNA阳性病例中11例合并丙型肝炎病毒感染。反映HGV主要经输血途径传播。在部分没有甲～戊型肝炎证据的病人中的HGV感染，表现了肝功能异常，极个别有重症肝炎表现，是否HGV单独致病有待进一步研究[24～29]。
2.4 TT病毒感染调查
我们对340名ALT正常和19名ALT异常健康体检者的血清，90份献血员，60例血透患者和156例肝病患者的血标本，采用PCR检测TTV DNA，其检出率分别为1.8%、10.5%、2.2%、8.3%和4.5%，其中ALT升高体检人群和血透患者的TTV DNA检出率显著高于ALT正常健康体检人群，P值分别为<0.05和<0.01。
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由广东分离的TTV病毒，经PCR产物测序，其同源性与Takahashi等分离株和Okamoto等分离株相比分别为98.2%和89.2%。在肝炎病人中TTV病毒与其它肝炎病毒重叠感染，无法确定其单独致病性。
3 发病机理
3.1 慢性乙型肝炎急性发作与血清HBV DNA含量关系
采用荧光标记(amplisensor)定量方法测定11例患者中有9例(82%)血清HBV DNA含量的高峰值是在最大肝损害之前出现，或与谷丙转氨酶(ALT)同时达到高峰。另2例的高峰值则出现在恢复期。测定2例数次发作的慢性乙型肝炎患者的系列血清中HBV DNA，也显示了上述特点。另1例肝炎肝硬化多次急性发作中，显示持续高水平的病毒血症。对44例自发性发作的慢性乙型肝炎患者进行肝组织活检，比较其血清中HBV DNA含量，结果显示血清HBV DNA含量与肝脏炎症程度(G1～G4)及纤维化程度(S1～S4)之间无明显相关性(P<0.05)，与血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及总胆红素(T-Bili)之间也无相关性。这种情况可能是HBV的复制活跃先于肝损害加重，并可能是启动机体免疫应答的因素，但HBV DNA绝对值与肝细胞损伤的程度没有关系[30]。
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3.2 HBV感染者重叠HEV感染致病情明显加重
乙型肝炎病毒感染在人群中感染率高，重叠其它肝炎病毒感染可导致病情明显加重，尤以HEV明显。对384例慢性乙型肝炎感染检查重叠感染情况，其中16.6%重叠HEV感染，重症肝炎中更为明显(22.73%)[31～33]。
3.3 重症肝病患者体内TNF-α和IL-6水平的研究
为进一步探讨某些细胞因子在重症肝炎发病机理中的作用及其意义，我们用双抗体夹心ELISA法测定了30例重症肝炎患者血清肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)水平的变化。研究结果提示血清TNF-α和IL-6水平与肝细胞坏死程度密切相关。重肝患者血清TNF-α和IL-6的显著升高亦与肝炎病毒的重叠感染和内毒素血症有密切关系。
为了在细胞因子水平上阐明严重感染与慢性肝病重症化之间的关系，探讨肝炎肝硬化失代偿期患者体内TNF-α和IL-6水平与感染的关系及其对诊断和预后的判断价值，我们检测了肝炎肝硬化患者血清和腹水TNF-α和IL-6水平。我们的研究结果表明， 肝硬化患者血清和腹水TNF-α和IL-6的检测对判断感染的存在和预后有一定的临床实用价值。 提出在腹水培养阴性的情况下， 腹水IL-6≥1 200 ng/L可作为诊断原发性细菌性腹膜炎(SBP)的一项指标，具有灵敏性较高，特异性较强，快速简便的优点[34，35]。
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3.4 HCV与HCC关系的研究
针对我国肝癌高发及丙型肝炎流行的状况，对丙型肝炎病毒(HCV)在肝癌发生中的病因作用及与其它因素的协同作用，从人群、细胞和分子等宏观到微观不同水平上率先进行了系列研究与报道。
3.4.1 在人群水平上 通过病例对照研究Logistic回归分析(3个样本，抽样于华南地区、广州市和顺德)，在我国HBV高流行背景下，发现HCV仍为独立的致肝癌因素(OR=8.0-15.8)；与HBV有协同致肝癌作用；不同肝病组的病毒血清学、临床和病理比较分析均揭示HCV、HBV重叠感染是我国肝癌的突出现象。临床上随访66例重叠感染病例，41个月后发现肝硬化发生率(32.25%)显著高于单独HBV或HCV组，并在重叠感染组中出现2例原发性肝癌提示肝硬化是重要的中间环节。
3.4.2 在组织细胞水平上 采用地高辛标记逆转录原位PCR技术，分析HCV RNA在肝癌组织中的定位和分布，发现肝癌和癌周肝组织中HCV RNA主要呈胞浆型分布，在癌细胞中核型、核膜型分布明显增高，免疫组化分析也证实肝癌组织中HCV抗原的存在和分布特点，表明HCV基因组与宿主基因组可能存在相互作用，并与HCV的致癌机理有关；采用高效液相色谱定量检测肝癌组织中的黄曲霉毒素，同时用改进的巢式PCR技术检测肝癌组织中的HCV RNA和HBV DNA，这3种因子的检出率分别为69.2%、12.7%和90.5%。发现HCV与HBV或者黄曲霉毒素双阳性或三阳性时存在着明显的协同致癌作用。协同致癌作用的理论观点可较合理地解释我国东南沿海肝癌高发的现象。由于我国HBV感染基数高，黄曲霉毒素污染实际存在而易忽视，协同致癌作用的观点为采取综合措施降低华南特别是广东省肝癌高发提供了重要理论依据。
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3.4.3 在分子水平上 利用特异性引物的限制作用，在国内首次在肝癌组织中鉴定并报道(1993年上海国际肝病会议)存在HCV复制中间体，提供了HCV与肝癌相关的深入证据；用克隆测序的方法从肝癌患者血清中获得780 bp的HCV cDNA片段，序列分析表明，与我国HCC相关的HCV为Ⅱ型病毒，并在特殊氨基酸位置存在较大变异，这在国内亦为首次报道；采用PCR/SSCP、PCR/RFLP技术结合DNA序列分析，首先报道了广东地区肝细胞癌患者中宿主基因— p53基因的突变情况，突变率为36%，突变部位95.8%在密码子249，突变方式为第3个碱基的G→T转换。采用新方法直接观察到p53基因的杂合性丢失情况，杂合性丢失率为68.4%。进一步分析发现，HBV、HCV感染与p53基因改变密切相关，揭示HBV DNA的存在，以及HBV、HCV感染引起的肝硬化过程是HBV、HCV感染与p53基因改变的重要因素。黄曲霉素摄入和HBV、HCV感染是p53基因密码子249突变的主要原因，其中，HBV、HCV感染的意义相对重要，因为，病毒感染不仅能引起突变还可引起基因发生杂合性丢失[36～52]。
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以上系列研究的结果和发现，为我国特别是华南地区肝癌的一级预防和二级预防提供了重要实验和理论依据，提出切实地采取综合处理措施，阻断协同致肝癌作用，对降低肝癌率的发病具有重要意义。
3.5 病毒性肝炎与脂肪肝的发生
在69例非酒精性脂肪肝患者中分别检出HBs-Ag阳性25例(36.23%)、抗HCV阳性8例(11.59%)，合计HBV与HCV现症感染率为47.82%；对照组138名健康体检者中HBsAg阳性17例(12.32%)，抗HCV阳性2例(1.45%)，合计HBV与HCV现症感染率为13.77%(两组比较P值分别<0.01、0.01和0.001)。调查显示在非酒精性脂肪肝患者中普遍存在慢性HBV、HCV感染。结果提示持续存在慢性HBV、HCV现症感染与脂肪肝有密切关系，可能是非酒精性脂肪肝的重要原因之一[53～55]。
4 治 疗
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4.1 抗病毒治疗
4.1.1 α-干扰素治疗乙型与丙型肝炎的临床疗效近5年时间，我们使用各种干扰素(INF)治疗乙型与丙型肝炎近500余例，获得了丰富的临床经验。我们应用α-干扰素(INF-α)治疗急、慢性丙型肝炎患者，以同期收治而未用INF-α治疗的病例作随机对照，观察INF-α治疗丙型肝炎的临床疗效和远期疗效(停药后随访6～12个月)。结果表明，急性丙型肝炎患者应用INF-α治疗3～6个月后，ALT复常率为80%，对照组为20%，停药后半年内复发率为37.5%，疗效显著优于对照组。慢性丙型肝炎患者应用INF-α治疗6个月后，ALT复常率为40%，停药后复发率高。INF-α治疗组血清HCV RNA的阴转与ALT的复常有密切相关，而大多数患者治疗前后血清抗-HCV的效价无显著差异(P>0.05)，故不认为血清抗-HCV是临床上考核IFN抗病毒疗效的灵敏指标。INF治疗乙型肝炎可使部分(25%～40%)HBeAg转阴，虽然INF治疗乙型肝炎的疗效不尽人意，但国际上依然将其作为乙型肝炎抗病毒治疗的首选药物。经过大量临床观察，我们应用INF治疗丙型肝炎用隔天3MU，12个月疗程，治疗乙型肝炎用隔天5MU，不少于6个月的疗程[56～58]。
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我们比较了4种常用的干扰素制剂，在98例病毒性肝炎病人，治疗前后，治疗期间干扰素抗体的产生情况，结果显示：总的阳性率为34.7%；该抗体的产生与病人的性别、年龄、治疗前ALT水平、肝炎病毒感染类型、以及肝炎的临床类型均无显著相关。低剂量干扰素较易产生中和抗体。使用不同干扰素制剂产生中和抗体有差异，其中以r-INF-α 2 α最高，INF-α N1最低。但抗体的出现对干扰素的疗效影响不大[59]。
4.1.2 拉米夫定治疗慢性乙型肝炎病毒感染 HBV不断复制，病毒不能清除是造成慢性乙型肝炎反复发作，迁延不愈的主要原因，近10多年来慢性乙型肝炎的抗病毒治疗一直是国内外临床研究的热点，虽然α-干扰素及一些免疫调节剂对抑制HBV的复制有一定的效果，但疗效远不尽人意。
拉米夫定(2，-3-双脱氧核苷3-硫胞嘧啶)是一种毒性低、在人体内吸收快、生物利用度大的新的胞嘧啶核苷类似物。我科被卫生部指定为该药在全国多中心进行临床试验单位之一。从1996年12月开始对88例慢性HBV感染者进行了严格按照美国FDA要求和中国卫生部新药临床研究指导原则的临床试验：88例随机分入拉米夫定治疗组(66例)和安慰剂对照组(22例)，在头12周，按双盲法每人每天口服拉米夫定100 mg(1片)，或安慰剂1片，第13周起所有病人均继续服拉米夫定100mg.d-1，至52周末结束。结果在头12周结束时，HBV DNA阴转率拉米夫定组为92%，安慰剂组均仅为9%，两组比较P<0.001。在52周治疗结束时，拉米夫定组及安慰剂组的最终HBV DNA阴转率分别为69%与77%，但若扣除中途脱落者，两组的HBV DNA阴转率实际分别为87.5%(42/48)与85%(17/20)，两组的ALT复常率亦相似(65%对70%)，统计学均无显著差异(P>0.05)，血清HBeAg阴转，抗-HBe阳转率治疗前后无明显差异。
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两组病人在治疗1年中，对拉米夫定的耐受性均良好，两组不良反应发生频率均相似，并无严重不良反应或肝、肾功能损害、骨髓抑制等发生。结论认为拉米夫定能迅速有效抑制HBV的复制，并可改善肝功能，口服100 mg.d-1,1年的治疗安全、有效。
4.2 基因治疗的应用基础研究
4.2.1 硫代修饰三螺旋形成寡脱氧核苷酸及反义寡脱氧核苷酸抗HBV作用研究 ①以HBV核心启动子1 734～1 754 nt(含SP1位点)、前C RNA、前基因组RNA5′端帽区及翻译起始区为靶点，设计、合成了21 mer硫代修饰三螺旋形成寡脱氧核苷酸(TF 021)、反义寡脱氧核苷酸(ODNas 21)及无关序列对照寡脱氧核苷酸(ODNcon)。②在HBV模型细胞— HepG 2 22.1.5细胞研究了TF 021、ODNas 21对HBV复制及抗原合成的抑制作用。③研究了TF 021、ODNas 21对HepG 2 22.1.5细胞的毒性作用。结果：①TF 021，ODNas 21能有效抑制HBV复制及HBsAg，HBeAg合成。②该抑制与作用时间有关，并呈剂量依赖性。③TF 021与ODNas 21 联合给药抑制作用增强。④硫代寡核苷酸对22.1.5细胞无毒性作用[60]。
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4.2.2 逆转录病毒介导反义HBV前C/C基因转移的抗HBV作用研究 ①用BamHⅠ酶切HBV(ayw)质粒pHBV获得了1 504 bp的HBV前C/C基因片段，将其正、反向插入逆转录病毒载体pDOR，构建了正、反义前C/C重组体。②将重组体转染逆转录病毒包装细胞PA317，用G 418筛选获得了抗性细胞及正、反义重组逆转录病毒。③采用PCR及RT-PCR检测了逆转录病毒载体介导反义前C/C基因转移及产生HBV反义RNA的水平。④在22.1.5细胞研究了逆转录病毒介导的反义HBV前C/C基因转移的抗HBV作用及对22.1.5细胞的毒性作用。结果：①逆转录病毒载体能有效转移反义前C/C基因并能转录、产生HBV反义RNA。②在22.1.5细胞，逆转录病毒介导的反义HBV前C/C基因转移、表达能有效抑制HBV复制及HBsAg、HBeAg合成，该抑制具有特异性。③增加重组逆转录病毒感染次数能在一定程度提高抗HBV作用。④重组逆转录病毒感染对22.1.5细胞无明显毒性作用[61]。
4.3 慢性肝炎肝硬化的中西医结合治疗
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于1986年开始从事这方面的研究。自此以后10年来，本科先后开发肝酶灵注射液、和肝胶囊、宁肝丹胶囊、复肝酶胶囊、强肝胶囊等多种制剂，在本科肝病患者中应用，并逐渐形成医疗特色，创造了良好而稳定的社会与经济效益。
4.3.1 肝酶灵注射液对慢性病毒性肝炎尤其是乙型肝炎进行了较大规模和较长时间的临床应用 通过66例慢性乙型肝炎患者的对照观察表明，经过疗程为3个月的肝酶灵肌肉注射治疗，原先ALT呈2倍以上升高的患者获得77.27%的复常率，并且53.03%的患者出现HBeAg阴转，两项指标均明显优于对照组。结果表明肝酶灵注射液对慢性乙型肝炎不但具有保护肝细胞作用，同时还观察到一定的抑制HBV复制的作用。肝酶灵注射液价格较为低廉，是一种适合我国国情的制剂[62，63]。
4.3.2 改良小柴胡汤制剂——和肝胶囊 我们曾应用和肝胶囊对81例肝病患者进行治疗，观察其对血清肝纤维化标志物的影响。结果显示和肝胶囊治疗可使血清透明质酸(HA)和Ⅲ型前胶原肽(PHIP)由治疗前的(245.89±148.49) μg/L和(261.89±134.42) μg/L分别降至(125.43±85.46) μg/L和(144.04±83.99) μg/L(P=0.000)，下降幅度分别为(120.45±89.71) μg/L和(117.85±73.64) μg/L，均优于对照组；治疗组的HA和PIIIP复常率分别为34.38%(22/64)和50.68%(37/73)。提示改良小柴胡汤制剂对肝纤维化过程具有一定的抑制作用[64]。
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4.4 抗肝炎药物的临床验证
近年来，作为卫生部抗肝炎与寄生虫药物临床试验基地以及广东省新药(抗感染)临床试验研究中心，我们接受国内外数10种与治疗肝炎有关的药物如：α-胸腺素(日达仙)、前列腺素、肝细胞生长因子等进行临床验证。为肝炎的上市治疗药物进行评估，从而为临床正确使用提供了依据。
在病毒性肝炎诊治方面，我们做了大量的工作，取得了较大的成绩，为广东省病毒性肝炎防治作出了积极的贡献。由于病毒性肝炎防治工作难度大，仍然有许多问题尚未解决。因而，将在我们已有的研究工作基础上，对一些病毒性肝炎热点与焦点问题，特别是发病机理、定量检测、新的治疗方法的研究与应用等方面进一步深入研究。
卫生部部属校重点项目、卫生部优秀人才等基金资助课题；获国家教委科委进步二等奖
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